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原名
Gastriccancer-derivedexosomalmiR-a-3ppromoteslivermetastasisbyinducingintrahepaticM2-likemacrophage-mediatedangiogenesis
译名
胃癌衍生的外泌体miR-a-3p通过诱导肝内M2样巨噬细胞介导的血管生成促进肝转移
主题概述
01背景
肝转移（LM）是胃癌（GC）患者预后的主要障碍，但胃癌肝转移（GC-LM）的分子机制尚不清楚。外泌体被认为是肿瘤细胞和微环境之间沟通的重要媒介。
因此，本文使用小管形成测定、主动脉环测定和外泌体培养的GC-LM模型来研究GC衍生的外泌体和exo-miR-a-3p在血管生成和GC-LM中的作用。
采用荧光素酶报告物测定、qRT-PCR、Westernblot、ELISA、流式细胞术和免疫荧光等方法研究了exo-miR-a-3p在GC-LM中的调节机制。
02研究发现
GC-LM患者血清外泌体中miR-a-3p的表达水平显著高于非LM患者，exo-miR-a3p的高表达表明预后更差。
GC衍生的外泌体主要积聚在肝脏中，并被肝内巨噬细胞内化。
机制上，exo-miR-a-3p通过靶向DUSP2激活MAPK/ERK通路，从而导致巨噬细胞的M2样极化。
M2样极化巨噬细胞通过诱导血管生成和促进肝内转移前生态位形成来加速GC-LM。
综上，exo-miR-a-3p在介导原代GC细胞和肝内巨噬细胞之间的串扰中起关键作用，并且是GC-LM的潜在治疗靶点。
研究路线及研究过程
原理简述
研究过程
1.GC衍生外泌体促进肝转移
通过超速离心从MKN45和MKN45-HL细胞的上清液中分离出外泌体。
通过电子显微镜和纳米颗粒追踪分析(NTA)进行表征和定量(图1A)。通过电子显微镜观察到直径为30至nm的典型杯状和双膜结构颗粒，NTA还显示来自两个细胞系的外泌体略大于nm(图1B,C)。
通过分析外泌体标记物(TSG和CD81)和确认内质网(calnexin)的缺失来评估源自MKN45和MKN45-HL的外泌体的纯度(图1D)。
为了研究GC细胞衍生的外泌体是否能促进GC-LM，在尾静脉向小鼠静脉注射PBS、MKN45外泌体和MKN45-HL外泌体，然后在脾脏注射荧光素酶标记的MKN45细胞。三周后进行了体内成像，结果表明，与PBS组相比，GC衍生的外泌体显著增加了小鼠肝脏中的荧光强度，并且在MKN45-HL衍生外泌体组观察到了最强荧光信号(图1F)。
处死小鼠，称重肝脏并进行HE染色。结果表明，与PBS组相比，GC衍生的外泌体显著增加了肝转移的大小和数量，特别是MKN45-HL衍生的外泌体(图1G-I)。此外，CD31的免疫组织化学染色显示，与PBS相比，GC衍生外泌体导致肝转移中和周围的血管明显更为紊乱(图1J)。
因此，这些结果表明GC衍生的外泌体在GC-LM中起着重要的调节作用。
图1GC衍生的外泌体促进肝转移
(A)来自MKN45和MKN45-HL细胞的外泌体在TEM下的代表性图像，比例尺=nm。
(B.C)通过NanoSight分析纯化的MKN45和MKN45-HL外泌体。
(D)MKN45和MKN45-HL细胞外泌体和裂解物中外泌体标记物(TSG和CD81)的蛋白质印迹分析。
(E)外泌体建立GC-LM模型建立过程的示意图。
(F)分别用PBS、MKN45外泌体或MIN45-HL外泌体培养后，将荧光素酶标记的MKN45细胞注射到脾脏中的小鼠的代表性体内成像系统(IVIS)结果。生物发光成像信号的量化值的结果表示为平均值±标准差(n=6)。
(G-I)GC衍生外泌体对小鼠肝转移的影响。显示了肝转移、肝重量和HE染色的代表性照片。比例尺分别为1.0cm和μm。
(J)外来体教育小鼠LM组织CD31免疫组化染色的代表性图像，比例尺=μm。数据显示为3个独立实验的平均值±标准差，使用单因素方差分析检验确定统计显著性(*P0.05，**P0.01，***P0.)。
2.GC衍生的外泌体促进肝内巨噬细胞的M2样极化
为了研究对GC衍生的外泌体敏感的器官，通过尾静脉将来自MKN45和MKN45-HL细胞的荧光标记外泌体注射到小鼠体内。对每个器官的荧光强度分析表明，在所有情况下，GC衍生的外泌体在肝脏中的富集程度明显高于其他器官。
此外，来自MKN45-HL细胞的外泌体比来自MKN45细胞外的外泌体更容易被肝脏内化(图2A)。随后检查了肝脏中最有可能吸收肿瘤外泌体的主要细胞(图2B)，肝组织的免疫荧光染色显示，MKN45-HL和MKN45衍生的外泌体(PKH26标记)与肝内巨噬细胞(F4/80+)共存。
随后，用12-肉豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)处理的人THP-1单核细胞用于模拟巨噬细胞。受刺激的细胞表现出明显的粘附形态，并高度表达识别的巨噬细胞标志物CD68。
然后将肿瘤衍生的外泌体与PMA处理的THP-1细胞共培养，结果表明MKN45-HL和MKN45衍生的外泌体均被巨噬细胞内化(图2C,D)。由于微环境的变化，巨噬细胞转变为经典活化表型(M1)和替代活化表型(M2样)，M2样巨噬细胞在肿瘤发展和转移中发挥重要作用。
RT-PCR结果显示MKN45-HL外泌体显著增加(CD、IL-10、TGF-β)，与PBS和MKN45外泌体相比，PMA处理的THP-1细胞中iNOS和TNFA(M1巨噬细胞标记物)的表达显著降低(图2E,F)。
通过流式细胞术检测PMA处理的THP-1细胞中CD的表达，结果表明MKN45HLexo显著促进了CD表达(图2G)，体内实验中也观察到类似的结果。与PBS相比，来自外泌体培养小鼠的肝脏的CD免疫荧光染色显示，来自GC细胞的外泌体，特别是具有高肝转移潜能的细胞(MKN45-HL)，显著促进了CD的表达(图2H)。
上述结果表明，GC衍生的外泌体主要被肝内巨噬细胞吸收，并可促进其转化为M2样表型。
图2GC衍生的外泌体促进肝内巨噬细胞的M2样极化
(A)将来自MKN45和MKN45-HL细胞的PKH26标记的外泌体注射到尾静脉后，小鼠肝、肺、脑、骨和肾组织的代表性荧光图像。
(B)代表性免疫荧光显示，尾静脉注射PKH26标记的外泌体后，小鼠肝脏中外泌体和巨噬细胞(F4/80)共定位。比例尺=50μm。
(C,D)显示PKH26标记的MKN45/MKN45HL衍生外泌体(红色)被PMA处理的THP-1细胞内化的代表性免疫荧光图像。比例尺=20μm。
(E,F)通过RT-PCR检测与MKN45/MKN45HL衍生外泌体或PBS(对照)孵育的PMA处理的THP-1细胞中典型M2标记物(CD、IL-10、TGF-β和VEGF-A)和M1标记物(iNOS和TNF-A)的表达。
(G)通过流式细胞术检测GC细胞衍生外泌体对CD(M2标记物)表达的影响。
(H)用PBS、MKN45外泌体或MKN45-HL外泌体培养的小鼠肝脏中CD(M2标记物)和F4/80(巨噬细胞标记物)的免疫染色。比例尺=50μm。数据显示为3个独立实验的平均值±标准差，使用单因素方差分析检验确定统计显著性(*P0.05，**P0.01，***P0.)。
3.GC衍生的外泌体通过M2样巨噬细胞促进血管生成，以促进肝转移
与PBS和MKN45exo相比，MKN45HLexo显著增加了PMA处理的THP-1细胞中血管相关细胞因子的分泌(图3A)。
Transwell分析表明，与MKN45HLexo预孵育的PMA处理的THP-1细胞的上清液显著增加了HUVEC的迁移(图3B,C)。
进行T管形成测定和主动脉环测定，以检测GC衍生外泌体极化的巨噬细胞是否影响血管生成。与PBS和MKN45-exo相比，来自PMA处理的THP-1细胞的条件培养基与MKN45-HLexo预孵育显著增加了HUVEC中形成的小管数量和小鼠主动脉环的芽(图3D)。
研究中发现，用GC衍生的外泌体直接孵育主动脉环或向PMA处理的THP-1细胞添加Panobinostat(一种HDAC抑制剂，已显示其在体内和体外强烈阻断巨噬细胞的M2型极化)不会促进主动脉环的萌发(图3E,F)。
用外泌体培养的小鼠同时腹膜内给予Panobinostat或DMSO。这些小鼠肝脏的CD31染色显示，MKN45HL衍生的外泌体显著促进了小鼠肝脏中无组织新生血管的形成，但当用Panobinostat治疗小鼠时，这种促血管生成作用显著减弱(图3G)。这表明由GC细胞衍生的外泌体介导的巨噬细胞的M2样极化参与了血管生成的调节。
为了进一步研究M2样巨噬细胞介导的血管生成对GC-LM的影响，KRN-是一种有效的VEGF受体抑制剂，用于外泌体培养的GC-LM模型。(图3H)，小鼠体内成像显示，KRN-处理显著降低了小鼠肝脏的荧光强度。随后，小鼠肝脏的重量和HE染色显示出一致的结果(图3I)。此外，CD31的免疫组织化学染色显示，用KRN-治疗显著抑制小鼠肝转移瘤及其周围的血管生成(图3J)。
以上结果表明，GC衍生的外泌体通过M2样巨噬细胞促进血管生成，以促进GC-LM。
图3GC衍生的外泌体通过M2样巨噬细胞促进血管生成以促进肝转移
(A)用GC细胞衍生外泌体或PBS预孵育的巨噬细胞上清液通过ELISA检测TGF-β、VEGF-A和VEGF-D的分泌。
(B,C)Transwell分析评估了与用PBS、MKN45外泌体或MKN45-HL外泌体处理的巨噬细胞共培养的HUVEC的迁移能力。显示了迁移细胞的代表性图像。比例尺=μm。
(D)测定与条件巨噬细胞共培养的HUVEC的管形成。比例尺=μm。
(E,F)主动脉环在条件培养基中培养，通过计数一个环中的所有芽来量化血管生长。使用三种培养环境：(裸)外泌体直接添加到血管环的培养基中；与外泌体一起孵育的PMA处理的THP-1细胞的(Exo)上清液；加入(Exo+Pan)Panobinostat(0.μM)，同时THP-1与外泌体孵育，然后提取上清液用于血管环培养。比例尺=μm。
(G)小鼠在接受外泌体调节的同时腹腔内给予Panobinostat(每2天20mg/kg)，两周后通过CD31免疫组化观察肝脏血管生成。比例尺=μm。
(H)用外泌体培养的小鼠同时用KRN-(50mg/kg，每2天洗胃一次)或DMSO处理，然后用荧光素酶标记的MKN45细胞门静脉注射。使用体内成像系统(IVIS)检测并量化转移瘤中的荧光信号。
(I,J)然后处死小鼠，对其肝脏进行拍照、称重和CD31免疫染色。数据显示为3个独立实验的平均值±标准差，并使用单因素方差分析检验确定统计显著性(*P0.05，**P0.01，***P0.)。
4.miRa3p在具有高肝转移潜能的GC细胞的外泌体中高度表达，并可通过外泌体转移至巨噬细胞
对从MKN45和MKN45-HL细胞分离的外泌体进行miRNA测序，以确定GC-LM中涉及的靶点(图4A)。共鉴定了个差异表达的miRNA(Foldchange＞2或＜0.5；FDRp值＜0.05)，包括MKN45-HL外泌体中71个下调的miRNA和个上调的miRNAs(图B)。从15名GC-LM患者和15名无LM的GC患者的血清外泌体中选择了前6个上调的miRNA进行初步验证，表明miRa-3p是上调最多的miRNA(图4C)。
与没有LM的GC组织相比，在GC-LM组织中观察到miR-a-3p的表达更高。随后，miR-a-3p在外泌体(exo-miRa-3p)中的表达在GC细胞和扩增样品的血清中得到进一步验证。
结果表明，它在具有高LM电位的细胞和来自GC-LM的血清中显著高表达(图4D,E)。此外，受试者操作特征曲线(ROC)表明，血清中exo-miR-a-3p的表达可以作为GC-LM的潜在诊断标志物(图4F，AUC=0.，p=0.1)。Kaplan–Meier生存分析表明，血清中exo-miR-a-3p的表达与GC-LM患者的终点呈负相关(图4G，p=0.)。
外泌体的一个重要功能是通过向其他细胞输送生物活性分子来影响细胞功能。在之前的研究中，发现GC衍生的外泌体主要被肝内巨噬细胞吸收。
因此，接下来研究了外泌体中的miR-a-3p是否也可以通过外泌体输送到巨噬细胞中(图4H)。PMA处理的THP-1细胞与来自MKN45-HL和MKN45细胞的外泌体一起孵育，表达比PBS更多的miR-a-3p。然而，当通过超速离心去除上清液中的外泌体时，PMA处理的THP-1细胞中miR-a-3p的浓度没有进一步增加(图4I)。
通过免疫荧光观察到，用Cy3标记的exo-miRa-3p在与PMA处理的THP-1细胞共培养后被其内化(图4J)。
这些结果表明，miR-a-3p在GC衍生的外泌体中高度表达，其在血清中的表达水平与GC-LM患者的预后密切相关，并且可以通过外泌体传递给巨噬细胞。
图4AS-IV激活BMSCs中的AKTIGSK-3β/β-catenin通路
(A)与MKN45细胞相比，外体miRNA的热图显示MKN45-HL细胞上清液中的显著差异(n=3)。
(B)exo-miRNA-seq的火山图显示miRNA表达显著上调和下调。
(C)exo-miRNAseq中前6个上调的miRNA通过qRT-PCR在患有或不患有LM的GC患者的血清外泌体中进一步验证。
(D)通过qRT-PCR检测来自六种不同GC细胞系和一种正常胃粘膜上皮细胞系的外泌体中miR-a-3p的表达水平。
(E)通过RT-PCR检测了30名患有/不患有LM的GC患者和15名健康志愿者中exo-miR-a-3p的表达。
(F)ROC曲线是基于30名GC-LM患者血清中exo-miR-a-3p的表达而生成的。
(G)KM图是基于30名GC-LM患者血清中exo-miR-a-3p的表达生成的。根据ROC曲线的结果确定截止值。
(H)PMA处理的THP-1细胞与PBS或GC细胞(MKN45和MKN45-HL)衍生的外泌体孵育48小时，然后通过qRT-PCR检测THP-1细胞中miR-a-3p的表达。
(I)PMA处理的THP-1细胞与GES-1、MKN45和MKN45-HL细胞的正常上清液和无外泌体上清液(通过超速离心去除)一起培养48小时。随后，通过RT-PCR检测THP-1细胞中miR-a-3p的表达。
(J)左侧面板显示了在添加源自MKN45细胞的PKH67标记的外泌体12小时后，PMA处理的THP-1细胞中Cy3荧光和PKH67脂质染料的存在。比例尺=20μm。数据显示为3个独立实验的平均值±标准差，使用studentt检验、单因素方差分析和对数秩分析确定统计显著性(*P0.05，**P0.01，***P0.)。
5.ExomiRa3p诱导巨噬细胞的M2样极化，以促进血管生成并促进肝转移
为了研究exo-miR-a-3p在GC-LM中的作用，构建了分别具有miR-a-3p稳定过表达和敲低的MKN45和MKN45-HL细胞系。
通过CCK-8测定、transwell测定和异种移植瘤皮下植入研究了细胞内miR-a-3p的异常表达是否会影响MKN45和MKN45-HL细胞的生物学行为。
结果表明，MKN45和MKN45-HL细胞中miR-a-3p的敲低或过表达对GC细胞的增殖、迁移、侵袭和皮下肿瘤增殖几乎没有影响。
GC衍生的外泌体显示通过诱导肝内巨噬细胞的M2样极化来促进LM，因此又研究了这种效应是否由外泌体中的miR-a-3p介导。
PMA处理的THP-1细胞与源自miR-a-3p过表达MKN45细胞的外泌体孵育的RT-PCR结果显示，M2标记物的表达显著上调，M1标记物下调(图5A)。当PMA处理的THP-1细胞与miR-a-3p抑制的外泌体孵育时，观察到M2和M1标记表达的相反趋势(图5B)。
通过流式细胞术检测外泌体孵育的THP-1细胞中的CD以及通过免疫荧光在外泌体培养的小鼠肝脏中检测到CD，表明miR-a3p-knokdown外泌体抑制CD表达，而miR-a-3p过表达的外泌体促进CD的表达(图5C)。
通过ELISA在PMA处理的THP-1细胞与条件外泌体孵育的上清液中检测TGF-β、VEGFA和VEGFD。这表明与阴性对照相比，miR-a-3p过表达和miR-b-3p抑制外泌体增加，并抑制了它们的表达(图5D)。
为了确定exo-miR-a-3p对血管生成的影响，HUVEC首先与PMA处理的THP-1细胞共培养，THP-1细胞与外泌体预孵育。Transwell分析显示，与miR-a-3p过表达和miR-a3p抑制的外泌体预孵育的THP-1细胞分别增加和降低了HUVEC的迁移能力(图5E)。
PMA处理的THP-1细胞的条件培养基与miR-a-3p过表达的外泌体预孵育显著增加了HUVEC和主动脉环芽形成的小管数量(图5F,G)。
使用外泌体形成的GC-LM模型来研究exo-miR-a-3p在GC-LM中的作用。IVIS的结果表明，与对照相比，miR-a-3p高表达外泌体的形成显著增加了肝脏中的荧光信号，而miR-a3p抑制的外泌体减弱了荧光信号(图5H)。
HE染色显示，与对照外泌体相比，miR-a-3p过表达的外泌体的形成促进了小鼠的肝转移，而在miRa-3p抑制外泌体的形成后，LM受到抑制(图5I,J)。
通过CD31的免疫组织化学染色，发现miR-a-3p过表达的外泌体显著促进了肝转移和周围组织中的血管生成，而miR-b-3p抑制的外泌体内与阴性对照相比抑制了血管生成。
这些结果表明，exo-miR-a-3p诱导M2巨噬细胞极化以促进血管生成和肝转移，而胞内miR-a-3p对原代GC细胞的表型影响有限。
图5xo-miR-a-3p诱导巨噬细胞的M2样极化，以促进迁移和促进肝转移
(A,B)PMA处理的THP-1细胞与来自miR-a-3p过表达MKN45细胞或miR-b-3p敲低MKN45-HL细胞的外泌体孵育。随后通过RT-PCR检测CD、IL-10、TGFB1、VEGFA、iNOS和TNFA的表达水平。
(C)PMA处理的THP-1细胞与敲低或过表达miR-a-3p的GC细胞衍生外泌体孵育。然后通过流式细胞术测量CD阳性THP-1细胞的百分比。
(D)通过ELISA测定exo-miR-a-3p对PMA处理的THP-1细胞中TGF-β、VEGFA和VEGFD分泌的影响。
(E)HUVEC的Transwell分析是在用PMA处理的THP-1细胞的条件培养基与miR-a-3p敲除/过表达外泌体预孵育48小时后进行的。比例尺=μm。
(F)HUVEC的微管形成测定在与PMA处理的THP-1细胞的条件培养基孵育后进行。比例尺=μm。
(G)PMA处理的THP-1细胞条件培养基对小鼠主动脉环血管生长的影响。比例尺=μm。
(H)用来自GC细胞的miR-a-3p抑制/表达的外泌体培养小鼠，然后将荧光素酶标记的MKN45细胞注射到脾脏中。3周后用IVIS评估肝转移。
(I,J)完成IVIS后处死上述各组的小鼠，收集肝脏进行照片和HE染色。比例尺=μm。数据显示为3个独立实验的平均值±标准差，使用Studentt检验和单因素方差分析检验确定统计显著性(*P0.05，**P0.01，***P0.)。
6.DUSP2MAPK/ERK轴是巨噬细胞中exo-miRa3p的功能靶点
为了确定miR-a-3p的下游靶点，用miR-b-3p抑制剂或阴性对照转染的PMA处理的THP-1细胞进行mRNA测序(图6A)。
通过将mRNAseq上调的基因(
log2Foldchange
1.5)与TargetScan和PITA数据库预测的基因相结合，确定了5个可能被miR-a-3p靶向的基因(图6B)。这五个基因在PMA处理的THP-1细胞中通过qRT-PCR进一步验证。
结果表明，在miR-a-3p敲除和过度表达后，只有DUSP2的表达显著改变(图6C,D)。基于生物信息学分析预测的DUSP2的3UTR中miR-a-3p的潜在结合位点(图6E)，进行了荧光素酶报告物测定。
当用Luc-DUSP2-3UTRWT和miR-a-3p模拟物共转染时，HEKT细胞中的荧光素酶活性显著减弱，而当用Luc-D-USP2-3UTRMUT和miR-a-3p模拟物共感染时，几乎没有观察到变化，这表明miRa-3p直接靶向DUSP2(图6F)。
Westernblot的结果显示，转染到PMA处理的THP-1细胞中的miR-a-3p的模拟物和抑制剂分别促进和抑制DUSP2的表达(图6G)。类似地，当分别用miR-a-3p高效或富集的外泌体培养小鼠时，观察到DUSP2在肝内巨噬细胞中上调或下调(图6H,I)。
此外，发现miR-a-3p模拟物对CD表达的贡献在与DUSP过表达质粒共转染后通过流式细胞术降低(图6J)。观察到PMA处理的THP-1细胞中DUSP2的过表达损害了miR-a-3p模拟物对TGF-β、VEGF-A和VEGF-D的促分泌作用(图6K)。因此，miR-a-3p通过靶向DUSP2诱导巨噬细胞的M2样极化，并增加其血管生成相关因子的分泌。
DUSP2是一种核磷酸酶，通过磷酸苏氨酸和磷酸酪氨酸残基的直接去磷酸化来特异性灭活ERK。为了研究miR-a-3p是否参与MAPK/ERK通路的激活，通过Westernblot检测了包括p-ERK1/2、p-cFOS和p-c-JUN在内的关键通路相关蛋白。结果表明，THP-1细胞中miR-a-3p的过度表达显著激活了MAPK/ERK通路，但这种激活被DUSP2的过度表达减弱(图6L)。
图6DUSP2-MAPK/ERK轴是巨噬细胞中exo-miR-a-3p的功能靶点
(A)在含有或不含有miR-a-3p抑制剂的PMA处理的THP-1细胞中进行mRNA测序。热图显示了敲除miR-a-3p后，前个基因的表达存在显著差异。
(B)确定了五种符合上调标准的mRNA(log2FC≥1.5)，并基于TargetScan和PITA预测为miR-a-3p靶点。
(C,D)通过RT-PCR检测用miR-a-3pNC/模拟物或miR-b-3pNC-抑制剂转染的PMA处理的THP-1细胞中五个靶的相对表达。
(E)DUSP2的3UTR和miR-a-3p之间的野生型和突变型结合位点的示意图。
(F)转染miR-a-3p模拟物/NC后，HEKT细胞中3UTR-DUSP2-uc构建体的相对荧光素酶活性。
(G)通过Westernblot检测PMA处理的THP-1细胞中DUSP2的表达，其中miR-a-3p过表达或敲低。
(H,I)通过RT-PCR和Westernblot检测来自miR-a-3p缺陷或富集外泌体培养小鼠的原代肝巨噬细胞中DUSP2的表达。
(J)通过流式细胞术测定miR-a-3p过表达或miR-b-3p/DUP2共表达PMA处理的THP-1细胞中CD-(M2标记物)的表达。
(K)ELISA检测miR-a-3p过表达或miR-b-3p/DUP2共表达PMA处理的THP-1细胞中TGF-β、VEGF-A和VEGF-D的分泌。
(L)在单独或一起转染miR-a-3p模拟物和DUSP2过表达载体的PMA处理的THP-1细胞中，通过Westernblot检测MAPK通路下游细胞因子p-ERK1/2、p-c-FOS和p-c-JUN的表达水平的变化。数据显示为3个独立实验的平均值±标准差，使用Studentt检验和单因素方差分析检验确定统计显著性(*P0.05，**P0.01，***P0.)。
MAPK是人类癌症中的一种重要致癌因子，参与巨噬细胞的M2样激活。因此，靶向抑制这一途径是治疗GC-LM的重要策略。
PD是一种公认的非ATP竞争性MEK抑制剂，有效抑制ERK1/2磷酸化，用于体外和体内实验。
Westernblot的结果显示PD处理显著抑制THP-1细胞中MAPK/ERK通路的激活，并且该抑制剂的加入显著阻断外泌体miR-a-3p激活这一途径(图7A)。
PMA处理的THP-1细胞的上清液与外泌体孵育并用PD处理，用于血管生成测定和主动脉环测定。用富含miR-a-3p的外泌体预培养的THP-1细胞的上清液显著增加了HUVEC中形成的小管数量和主动脉环的出芽。
当PMA处理的THP-1细胞用PD处理时，exo-miR-a-3p几乎不能发挥促血管生成作用(图7B,C)。在GC-LM模型中观察到类似的体内结果。在抑制剂的存在下，用miR-a3p富集的外泌体培养小鼠，以部分促进GC细胞的LM。
小鼠肝脏的IVSI、HE和CD31染色结果表明，口服PD后，exo-miR-a-3p几乎不能发挥其促进血管生成和LM的作用(图7D-H)。总之，这些结果表明，exo-miR-a-3p通过激活肝内巨噬细胞中的DUSP2-MAPK/ERK轴，为转移前生态位创造了丰富的血管环境。
图7DUSP2-MAPK/ERK轴是巨噬细胞中exo-miR-a-3p的功能靶点
(A)向PMA处理的THP-1细胞添加MEK1抑制剂(PD)后，MAPK通路中下游细胞因子p-ERK1/2、p-c-FOS和p-c-JUN的表达水平与对照或过表达miR-a-3p的外泌体预孵育。
(B)HUVEC的微管形成测定在与PMA处理的THP-1细胞的条件培养基(含或不含MEK1抑制剂)孵育48小时后进行，所述THP-1细胞与exo-miR-a-3p预孵育。比例尺=μm。
(C)PMA处理的THP-1细胞的条件培养基(含或不含PD)与富含miR-a-3p的外泌体或对照外泌体预孵育对小鼠主动脉环血管发芽的影响。比例尺=μm。
(D)用miR-a-3p过表达或控制的外泌体培养的小鼠同时用PD(20mg/kg，每2天洗胃一次)或DMSO处理，然后用荧光素酶标记的MKN45细胞进行门静脉注射。通过IVIS检测和定量转移瘤中的荧光信号。
(E–H)然后处死小鼠，收获肝脏进行称重、照相、HE和CD31染色。比例尺=μm。数据显示为3个独立实验的平均值±标准差，使用单因素方差分析检验确定统计显著性(*P0.05，**P0.01，***P0.)。
结论：
该研究提出了GC衍生的exo-miR-a-3p在通过诱导肝内巨噬细胞中的M2极化形成血管生成丰富的转移前小生境中的新作用(图8)。结果还表明，GC血清中的exo-miR-a-3p可能是诊断GC-LM的一个新的生物标志物，并且靶向exo-miR-a-3p的治疗可以防止肝脏中转移的形成，并为抗肿瘤转移治疗提供新的思路。
图8GC衍生的exo-miR-a-3p通过诱导肝内M2样巨噬细胞介导的血管生成促进肝转移的机制图